一篇文章带你了解保存粪便的常用方法 | 微生物专题

近年来，随着对肠道微生物研究的逐渐深入，大量的研究表明肠道微生物失调会导致多种疾病如代谢类疾病肥胖、糖尿病、粥样动脉硬化症和癌症等的发生。在当前肠道微生物组的研究中，由于粪便样品的易获得性，成为了研究肠道微生物的首选样品。通过提取粪便标本中的细菌DNA，并进行高通量测序，是了解肠道菌群多样性、组成等信息的重要环节。但粪便中的细菌DNA稳定性差，暴露在空气中或高温环境下易发生降解。因此，粪便样本的储存至关重要。下面给大家介绍几种保存粪便的方法，分别是冷冻保存法、冷藏保存法、保存液保存法。想要知道这些方法都有什么秘密吗？对于粪便样本的储存又有什么特点呢?赶紧往下一探究竟！

肠道菌群紊乱引起的一系列疾病

冷冻保存法

传统采用冷冻法保存粪便，即粪便采集后存放于-20℃或-80℃的温度中，在-80℃的温度下冷冻被认为是保存粪便的最佳方法（金标准）。该方法将采集后的粪便冻存在-80°C温度中，细菌在低温状态下代谢速率会降低，从而使粪便中细菌的构成在一段时间内得以维持，达到稳定其微生物构成的目的。粪便采集后立即（运输时间不超过30min）放入-80℃冻存可维持粪便菌群的原始结构与组成长达6个月^[1]。而在实际研究中，不容易做到立即将收集的新鲜标本进行速冻，多数样本会在室温或其他环境下暴露一段时间。如果保存不当，细菌DNA降解会造成标本中菌群种类和多样性下降，严重影响最终的实验结果。

干冰满足冷冻保存

冷藏保存法

 低温冷藏利用在低温条件下（主要是4°C条件）可以降低细胞内核酸内切酶活性以避免DNA被快速降解的原理来保存粪便。在4°C保存条件下，储存24小时不会显著改变粪便微生物群落结构^[2]。在临床实验中，由于实验人员不能立即把待分析的粪便样本放入- 80℃冰箱保存，特别是将样本转运回实验室的过程中，使用4°C冷藏箱或是0°C冰袋保存样本是一个可用的办法。这大大提高了临床上保存病人粪便样本的灵活性。一旦到达实验室，建议马上将样本转入- 80℃冰箱长期保存。

冰块满足低温保存

保存液保存法

因为新鲜粪便样本不易获得，且难以实现快速低温冷冻。随着技术的发展，保存液被广泛用于常温条件下的样品采集、储存和运输。粪便保存液的种类有许多，常用的保存剂有：乙醇、RNAlater、以及EDTA盐及柠檬酸钠等物质。乙醇和RNAlater在实验研究中运用较多，以下做些简单介绍。

乙醇溶液作为一种常用的固定剂，能快速渗入细胞，凝固降解DNA相关的酶，而不损伤DNA，从而达到较好的保存效果。有文献揭示95%酒精是常温短时保存粪便样品的良好选择，它可确保肠道微生物的组成和结构在室温下保存4天以内不发生显著变化^[3]。另有研究发现75%酒精可在5个月内保持粪便中微生物DNA的完整性，100%酒精可延长至8个月^[4]。这不难看出随着酒精浓度越高，对于DNA的保存效果越好。如果使用酒精来保存粪便样品，可使用95%或以上浓度的酒精，它能确保菌群的结构和组成在8周内不发生显著变化^[5]。但乙醇也有不太方便的地方，因其在长途运输中属于违禁品，携带较困难。

RNAlater是一种水性、无毒的储存试剂，能够抑制细菌生长，无需液氮冷冻粪便样品，可迅速渗透组织，不仅可以稳定和保护未冷冻标本中的细胞RNA，还能防止DNA降解。有研究表明RNAlater溶液可较好地保存大猩猩的粪便微生物DNA长达7年之久^[6]。人体微生物组计划（Human Metagenome Project)也将 RNAlater 作为其指定的粪便DNA保存溶液^[7]。

RNAlater试剂图

此外，一些研究也将用于细胞的传统低温保护剂应用于粪菌的低温保存中,比较常用的是甘油。甘油能在-20°C~-80°C时避免水结冰产生冰晶损伤细胞，且可以保持微生物活性，这一特性对于粪菌移植具有重要意义。有研究发现,用于治疗复发性艰难梭菌感染的粪菌微生物可以安全地在10％甘油中冷冻储存至少６个月,不会失去临床功效或活力，在临床治疗方面起到很大的作用^[8]。

参考文献

[1]Carroll Ian-M., Ringel-kulka Tamar, Siddle Jennica-P. Characterization of the Fecal Microbiota Using High-Throughput Sequencing Reveals a Stable Microbial Community during Storage[J]. PLoS ONE, 2012, 7(10): 0.

[2] Tedjo DI, Jonkers DM, Savelkoul PH, Masclee AA, van Best N, Pierik MJ, Penders J. The effect of sampling and storage on the fecal microbiota composition in healthy and diseased subjects. PLoS One. 2015 May 29;10(5):e0126685. doi: 10.1371/journal.pone.0126685. PMID: 26024217; PMCID: PMC4449036.

[3] Loftfield, E., E. Vogtmann, J. N. Sampson, S. C. Moore, H. Nelson, R. Knight, N. Chia & R. Sinha (2016) Comparison of Collection Methods for Fecal Samples for Discovery Metabolomics in Epidemiologic Studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 25, 1483-1490.

[4]李娜,李迪强,王秀磊,等. 粪便不同保存方法对动物基因组DNA提取效果的影响[J]. 国际遗传学杂志, 2006 ,29 (5) :341-345

[5] Song, S. J., A. Amir, J. L. Metcalf, K. R. Amato, Z. Z. Xu, G. Humphrey & R. Knight (2016) Preservation Methods Differ in Fecal Microbiome Stability, Affecting

[6]Drakulovski P, Locatelli S, Butel C, Pion S, Krasteva D, Mougdi-Pole E, Delaporte E, Peeters M, Mallié M. Use of RNAlater as a preservation method for parasitic coprology studies in wild-living chimpanzees. Exp Parasitol. 2013 Oct;135(2):257-61.doi: 10.1016/j.exppara.2013.07.002. Epub 2013 Jul 11. PMID: 23850999; PMCID: PMC3907073.

[7]Human Microbiome Project Consortium. A framework for human microbiome research. Nature. 2012 Jun 13;486(7402):215-21. doi: 10.1038/nature11209. PMID: 22699610; PMCID: PMC3377744.

[8]Costello SP, Conlon MA, Vuaran MS, Roberts-Thomson IC, Andrews JM. Faecal microbiota transplant for recurrent Clostridium difficile infection using long-term frozen stool is effective: clinical efficacy and bacterial viability data. Aliment Pharmacol Ther. 2015 Oct;42(8):1011-8. doi: 10.1111/apt.13366. Epub 2015 Aug 11. PMID: 26264455.

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